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上海達為科生物科技有限公司

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Co-IP
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是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔,已成為研究蛋白質相互作用的經典方法。

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一、服務介紹

**共沉淀Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔,已成為研究蛋白質相互作用的經典方法。

二、**共沉淀實驗原理

當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的很多蛋白質-蛋白質見的相互作用被保留下來。如果以細胞中某蛋白質為抗原,加入相應抗體,那么該抗體就能與抗原,以及與該抗原具有相互作用的蛋白質之間形成**復合物,一起沉淀下來。經過SDS-PAGE電泳,western blot和(或)質譜可鑒定出與抗原相互作用的蛋白質。

三、**共沉淀實驗流程

1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次,后一次吸干PBS;

2. 按比例加入適量預冷的RIPA 緩沖液;

3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下,把懸液轉到1.5EP管中,4°C,緩慢晃動(EP管插冰上,置水平搖床上);

4. 4°C離心后,立即將上清轉移到一個新的離心管中;

5. 準備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然后用PBS配制成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠;

6. 按比例加入Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃10minEP管插冰上,置水平搖床上),以去除非特異性雜蛋白,降低背景;

7. 4°C離心后,將上清轉移到一個新的離心管中,去除Protein A珠子;

8.用BCA法測定蛋白濃度,測前將總蛋白至少稀釋110倍以上,以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個月);

9. 用PBS將總蛋白稀釋到合適濃度;

10. 加入體積的預先稀釋的一抗;

11. 4°C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育;

12. 加入Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物,4°C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h;

13.瞬時離心5s,收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物,去上清,用預冷的洗液(或PBS)洗3遍;

14. 將上樣樣品煮5min,以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩余瓊脂糖珠,上清也可以暫時凍-20℃,留待以后電泳,電泳前應再次煮5min變性。

客戶提供:

1、新鮮的樣本材料(組織、細胞或蛋白溶液)

2、**沉淀的抗體(或由公司代購)及待測蛋白的相關信息

3、用于western blot的一抗

交付內容: 

實驗報告:詳細實驗步驟、圖片等。

服務列表

項目

備注

周期

Co-IP

含一個陽性蛋白和一個陰性蛋白檢測

20個工作日

Western blot

包括蛋白提取,每張膜按8個樣計算(其他三個為marker,陽性對照,陰性對照)

5個工作日


 




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